세 번째 줄에서 부가 설명을 할만하다.
전체 검량선 작성과정은 상대감응인자를 얻는 방향으로 진행된다.
우리는 외부표준물법에서 그랬던 것처럼 절대적 의미에서 검량선 작성을 행할 수는 없다.
이에 따라 세 번째 줄에는 농도나 주입량 또는 분석용 저울로 측정된 양(이는 미지량의 용매에 용해된다)
까지도 이용 가능하다.
중요한 것은 이들 숫자가 여러 성분에 대한 상대량이어야 한다는 것이다.
이 방법에서는 주입량은 그리 중요하지는 않다.
모든 성분이 주입량에 비례하여 증가하거나 감소하겠지만(직선성 범위내에 있는 한) 상대감응인자는
일정하기 때문이다.
그러나 주입량의 결정은 내부 표준물질의 선택만큼이나 중요하다.
이 시료는 크로마토그래프 분석을 행하기 전에 내부 표준물질 일정량을 함유시킨 것이다.
우리는 이 피크를 절대 검량선 작성을 위하여 사용할 것이며 이 피크에 비교하여 다른 시료 피크는
실제량을 알 수 있을 것이다.
시료에 대한 계산과정은 다음과 같다.
① 피크 면적을 해당 상대감응인자로 나누어 보정면적을 얻는다.
이 과정은 검출기의 감응정도가 일정하지 않은 효과를 제거해 준다.
② 보정 면적을 내부 표준물질로 나누어 내부 표준물질에 대한 각 성분의 상대량을 얻는다.
③ 각 상대량과 내부 표준물질의 실제량을 곱하여 각 성분의 실제량을 얻는다.
이 방법에 있어서 각기 다른 성분의 상대량을 계산함으로써 전 과정이 상대값에 기초하고 있다는 점에
주의하여야 한다.
내부 표준물법의 큰 장점은 미지성분과 표준물질이 동시에 주입되어 분석된다는 사실로부터 기인한다.
검출기 민감도의 변화가 모든 피크들에 동일하게 미친다면 그 상대량은 변화되지 않는다.
내부 표준물질로는 어떤 화학물질을 선택해야 하는가? 여기에 몇 가지 사항들이 고려되어야 한다.
* 반드시 고순도인 것으로 사용이 용이해야 한다.
* 보관중이나 크로마토그래피 시행중에 안정해야 한다.
* 모든 시료성분들과 반응하지 않아야 한다.
* 크로마토그래피로써 잘 분리되어 모든 시료 피크들과 확실하게 구분되는 좋은 형태의 피크를 내어야
한다.
* 시료에 용해 가능하여야 한다.
* 시료 성분에 필적할 만한 머무름 시간을 가져야 한다.
이것은 결코 쉽지 않은 요구 사항들이다.
이전의 많은 교과서들에서는 표준물질이 시료와 화학적으로 유사해야 한다는점이 추가되었다.
이는 위의 항목들중 마지막 두 가지를 확증하기 위한 것으로 보인다.
그러나 그 성질이 다소 애매한 물질(예, 케톤)이라도 우리의 연구에 포함시킬 수 있다.
내부 표준물질로 사용하기에 아주 유용한 화합물로 노르말 탄화수소가 있다.
이들은 순도, 안정성 그리고 비활성일 조건을 만족시키며 모든 고정상에서 크로마토그래피 시행에 좋은
결과를 낸다.
다만 극성 고정상에서 분리관이과부하되지 않도록 주의가 필요하다.
노르말 탄화수소는 시리즈로 구성되어 있으므로 우리는 끓는점이라는 변수를 선택하여
크로마토그램상에서 표준물질의 피크의 위치를 결정할 수 있다.
그렇게 함으로써 우리는 거의 항상 표준물질 피크위치로선정될 만한 빈 공간을 찾을 수 있다.
용해도 문제가 발생 가능한 문제의 하나이다.
탄화수소는 실제로 모든 유기 시스템에서 사용되므로 결국 아주 높은 용해도를 필요로 하지는 않으나
수용액 시스템에서는 다른 것을 사용하여야 한다.
이 경우 1차 알코올이 사용할만하다.
항상 단순한 화합물을 사용하는 것이 좋으며 이들은 기대하는 만큼의 순도를 얻기에 용이하며 잘
분해되지 않고 복잡한 분자구조로 된 화합물보다는 시료나 분리관과 덜 반응한다.